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内容目录
1、目的2、实验数据2.1 候选增强子识别2.2 转基因小鼠分析2.3 注释3、搜索数据库3.1 概括3.2 高级搜索3.3 搜索结果3.4 数据集页面4. Gallery5. 教程6. 试剂和胚胎可用性原文链接
1、目的
该项目的目的是鉴定人和小鼠基因组中的远距离转录增强子，首先通过各种计算和实验分析来完成鉴定推定的增强子元件，然后在转基因小鼠测定中进行测试以验证其体内功能并确定其活性模式。
2、实验数据
2.1 候选增强子识别
大多数增强子候选序列通过极端进化序列保守性分析或ChIP-seq鉴定，有关极端进化保守性分析进行增强子鉴定的详细信息可在以下出版物中找到：
- Pennacchio et al., Genomic strategies to identify mammalian regulatory sequences. Nature Rev Genet 2001
- Nobrega et al., Scanning human gene deserts for long-range enhancers. Science 2003
- Pennacchio et al., In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature 2006
- Visel et al., Enhancer identification through comparative genomics. Semin Cell Dev Biol. 2007
- Visel et al., Ultraconservation identifies a small subset of extremely constrained developmental enhancers. Nature Genet 2008
注意，该网站先前版本包括进化上保守的非编码人源序列的“计算数据集”，其由约170000个非编码序列组成，所述非编码序列在人和啮齿类动物之间高度保守，这些数据集不再跟新，但现在可以在http://pga.jgi-psf.org/gumby/上下载。
有关ChIP-seq增强子识别的详细信息，请参见以下出版物：
- Visel et al., ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature 2009
- Visel et al., Genomic views of distant-acting enhancers. Nature 2009
2.2 转基因小鼠分析
在本节中，我们概述了用于执行这些转基因分析的实验程序。
引物设计
设计PCR引物以扩增人/小鼠的候选增强子，通常在保守区域或ChIP-seq 峰的5'和3'两个方向上延伸数百个碱基对，以包括增强子活性所需的侧翼序列，但与核心共激活因子结合区域弱保守或（且）相邻。
克隆
为了增加构建载体产物的通量，我们使用（Gateway 热聪明比nationSystem）Gateway重组系统（Invitrogen），引物5'末端具有用于克隆到Gateway载体所需的序列（CACC），对人基因组DNA（BD Biosciences）进行PCR，对PCR产物进行序列验证，并使用制造商推荐的实验流程克隆到标准Gateway载体（pENTR/D-TOPO载体，Invitrogen）中。我们已经生成了Gateway兼容的报告载体，其含有Gateway盒和与LacZ报告基因偶联的Hsp68启动子。使用LR重组反应将每个克隆条目转移到目的报道载体中，并使用载体PCR和/或限制酶分析来确认成功插入转移。
显微注射到受精卵中
用XhoI或HindIII线性化质粒DNA，然后在Montage PCR过滤单元和Micropure EZ柱（Millipore）上纯化。 用注射缓冲液（10mM Tris，pH 7.5; 0.1mM EDTA）稀释DNA至终浓度为1.5至2ng / ul，并根据劳伦斯伯克利国家实验室批准的标准方案用于原核注射FVB胚胎。。
胚胎收获和LacZ染色
在胚胎发育第11天收获胚胎，并在冷PBS中解剖，然后在4℃下用4%多聚甲醛孵育30min；用洗涤缓冲液（2mM MgCl2；0.01% 脱氧胆酸盐；0.02% NP-40；100mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.3）将胚胎洗涤三次，每次30min；将胚胎在室温下用新鲜制备的染色溶液（0.8 mg/mL X-gal；4mM 亚铁氰化钾；4mM 铁氰化钾；20 mM Tris，pH 7.5 在洗涤缓冲液中）染色24小时，然后在PBS中漂洗3次然后在4%多聚甲醛中固定。从胚胎解剖卵黄囊，并将组织在75mL溶液1（25mM NaOH；0.2mM EDTA）中煮沸20min，然后用溶液2（40mM Tris-HCl）中和来制备DNA。用lacZ引物（LacZ-F5'-TTTCCATGTTGCCACTCGC;LacZ-R5'-AACGGCTTGCCGTTCAGCA）。
2.3 注释
每个阳性发育增强子是基于观察到的表达空间模式进行注释的，这些注释由组设置中的多个策划人完成，为了定义阳性增强子，元件必须在至少三个独立的转基因胚胎中以相同的结构显示可重复的表达。对于每个结构，我们提供观察到的模式的再现性，在至少三个不同的胚胎中观察到至少五个转基因胚胎已经获得但在任何结构中没有可再现表达的元件被定义为NEGATIVE。
所有胚胎都得到保存，并根据要求提供给外部查询人员进行自检和解释（见下文）。
可以在“图库”页面上找到大多数带注释结构的示意图和选定示例的集合。
3、搜索数据库
3.1 概括
截至2010年5月，Enhancer Browser包含大约1300种元件的转基因报告基因检测结果。这些元件来自小鼠或者人的基因组DNA克隆，可以从首页轻松搜索数据，可搜索字段包括：
_√_基因名称（侧翼测试增强子元件的基因）
_√_基因登录号
_√_轨迹链接标识符
_√_基因组坐标。 注意，基因组坐标可以是人（hg19）或小鼠（mm9）。 如果选择“both”，则将搜索两个物种中的相同坐标。
3.2 高级搜索
在高级搜索页面上，可以使用其它搜索选项。这些包括：
- 搜索在特定感兴趣组织中有活性的增强子（如果选择了多个条目，将报告任何所选结构中的增强子）
- 仅搜索阳性或唯一阴性元件
- 搜索仅限于人类或小鼠的增强子
- 搜索仅限于可获得组织切片的元件
3.3 搜索结果
搜索结果显示为一个列表，其中每行代表一个构造的数据，在同时测试小鼠和人同源物的情况下，显示两个单独的条目。列“ID”包含每个数据集的ID；前缀hs和mm分别指测试增强子活性的人或小鼠DNA。坐标链接表示克隆的增强子在物种的基因组位置；非超链接坐标表示相应其他物种中的直系同源区域（如果可用）。超链接“人类”和“小鼠”按相应物种中的元件ID对表格进行排序，超链接“坐标”按相应物种中坐标对表格进行排序（混合相应其他物种中的原始和直系同源坐标）。
“下载数据”链接允许将所有搜索结果批量下载为包含注释和增强子序列的单个FASTA格式的纯文本文件。
blue mouse picture
表示在体内增强子实验中观察到可再现的模式。
white mouse picture
表示在体内增强子实验中观察到不可再现的模式。
sections available picture
表示该数据集中的至少一个胚胎可获得组织切片组（在大多数情况下为大脑）。
3.4 数据集页面
为每个增强子提供了深入分析页面，可以通过搜索结果页面进行访问。 此页面上的信息包括：
序列坐标
侧翼基因
带注释的表达模式和每个结构的可重复性细节
个别胚胎的照片（点击照片获得更高分辨率的视图）
对于选定的元件，可以使用一系列部分（通常是头部的冠状部分）。 单击单个代表部分以打开部分浏览器。
测试的非编码区的序列
用于从基因组DNA扩增候选区域的引物序列。 请注意，对于大多数构建体，报告载体可供外部研究者使用（见下文）。
测试区域的进化序列保守概述。
4. Gallery
Gallery页面包含原理图视图和在大多数带注释的结构中有效的增强子的实际示例，以供参考。
5. 教程
OpenHelix提供了有关Enhancer浏览器和其他VISTA比较基因组学资源的在线教程
6. 试剂和胚胎可用性
用于大多数构建体的LacZ报告载体以及用于所选元件的存档（PFA存储的）转基因胚胎可根据要求提供给外部研究者。 请咨询Enhancer支持
